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【微生物的实验室培养】

一、基础知识

（一）培养基

1．概念：人们按照微生物对                  的不同需求，配制出供其                      的营养基质称为培养基。

2．种类：按物理性质分为        培养基和            培养基。按功能分为             培养基               培养基

3．营养构成：各种培养基一般都含有水、              、            和无机盐，此外还要满足微生物生长对         、                 以及           的要求。

 （二）无菌技术

1．获得纯净培养物的关键是防止外来         的入侵，具体操作如下：

(1)对实验操作的空间 、操作者的衣着和手进行清洁和            。

(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行             。

(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在                    附近进行。

(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与                      相接触。

二、实验操作

(一)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基

1.步骤：计算→           →         →             →           、

2.培养基配制时的注意事项

①全程要求无菌操作，无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还能有效地                                           。

②培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。可

以                               时，就可以进行倒平板。操作时应使锥形瓶的瓶口通过火焰，防止                              。

③平板冷凝后为什么要将平板倒置？

                                                                                                             。

④在倒平板的过程中，不能将培养基溅到皿盖与皿底之间的部位，因

为                                                                                                                                      。

(二)纯化大肠杆菌

1．平板划线法

①定义：通过接种环在                培养基表面的操作，将聚集的菌种逐步              到培养基的表面。

②操作的第一步灼烧接种环是为了避免                                           ；每次划线前灼烧接种环是为了                                                                                                                    ，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，                                                                                               。

③在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？                                                。

④在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                      。

2.稀释涂布平板法：将          进行一系列的            ，然后将不同           的菌液分别涂布到           培养基的表面，进行培养。

两种接种方法都是为了将聚集在一起的微生物                      ，得到由                         繁殖而来的肉眼可见的单个            。

3．鉴定：将接种后的培养基和一个          的培养基都放入             中，培养12 h和24 h后，分别记录观察。

4.菌种的保藏

①短期保存：将菌种接种到试管的              培养基上              中保藏，菌种易被污染或产生变异。

②长期保存：甘油管在                                 中保藏。

【土壤中分解尿素的细菌的分离和计数】

一、研究思路

1．筛选菌株

尿素是一种重要的农业氮肥，农作物不能直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为氨和CO2，才能被植物利用，土壤中的这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成          。可以利用这一特点，将其从土壤中筛选出来。

(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于         生长的条件(包括营养、      、pH等)，同时         或            其他微生物生长。

(2)选择培养基：在微生物学中，将允许                 的微生物生长，同时        和       其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。

2．统计菌落数目

(1)常用来统计样品中            数目的方法是                     。即当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的                 。通过统计平板上的             数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在               的平板进行计数。

通常统计出的菌落数比活菌的实际数目        。这是因为                                             。因此，统计结果一般用                 而不是活菌数来表示。

(2)                               也是测定微生物数量的常用方法。

二、对分离得到的分解尿素细菌的鉴定

在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的         将尿素分解成了_       _。氨会使培养基的碱性         ，pH           。因此，我们可以通过检测培养基       变化来判断该化学反应是否发生。在以        为唯一氮源的培养基中加入        指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变        ，说明该细菌能够分解尿素 。

【分解纤维素的微生物的分离】

一、纤维素与纤维素酶

纤维素酶的作用：纤维素酶是一种        酶，一般认为它至少包括三种组分

                。 

二、纤维素分解菌的筛选

1．筛选方法：                     法。这种方法能够通过               直接对微生物进行筛选。

2．筛选原理：刚果红是一种         ，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成        ，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后，培养基中出现以                为中心的            ，我们可以通过              来筛选纤维素分解菌。

三、实验设计

1．土壤取样

采集土样时，应选择                的环境。

2．选择培养

为了增加纤维素分解菌的             ，确保能够从样品中分离到所需微生物，可对样品进行                培养。

将土样加入装有              培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1～2 d，直至培养液变        。可重复选择培养。

3．梯度稀释

4．将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。

常用的刚果红染色法有两种，一种是先              ，再           ，另一种是在           时就加入刚果红。

5．挑选产生           的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。

为了确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行             实验，纤维素酶的发酵方法

有          发酵和_         发酵两种。纤维素酶测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的          含量进行定量测定。